蔡豐州醫師: 比較肉毒桿菌素注射與切神經的基礎研究

肉毒桿菌及脈衝光

比較肉毒桿菌素注射與切神經的基礎論文

題目: Comparison Between Neurectomy and Botulinum Toxin A Injection for Denervated Skeletal Muscle

發表期刊: Journal of Neurotrauma 2010;27:1509-16.
同時站長也受邀於國際會議 Aesthetic Asia 發表此創見
欲看全文可至我學術論文網站 www.bio-pattern.com

 

創新: 本基礎研究的主軸有下述幾個方向, 並據以陸續發表數篇論文, 作為支持我理論假說的基石:
(1) 藉由分析可以實驗控制的去神經化(denervation)現象, 其屬於崩解生物狀態(dissipative state) 與 動態變化(dynamic or time-series changes)之一, 除了可以了解肉毒桿菌素注射(BoNT-A injection) 與 切神經(neurectomy)的差別, 亦可以研究這些變化隨著時間改變的模式(pattern), 這已發表論文於J Neurotrauma 2010, 我最後得到結論:

a. 處於崩解狀態的生物組織呈現驚人的同時性(coherent)與雙相性(biphasic)動態模式(此論文驗證了細胞凋亡(apoptosis)與存活(survival)訊息傳導兩條路徑), 此結果有助於後續生物數學模型的建立;

b. 肉毒桿菌素注射與切神經的分子訊息差別在於 細胞凋亡誘發因子 硫胱氨酸蛋白酶-獨立 細胞凋亡路徑 (AIF mediated caspase-independent apoptosis pathway) 中的 細胞凋亡誘發因子 (AIF, apoptosis-inducing factor), 也就是切神經的AIF表現持續很高, 此結果有助於神經損傷與治療的後續研究與運用;

 

(2) 生物組織對應於環境產生時間序變化, 呈現動態狀態, 也就是外部刺激產生複雜的內部變化, 反之亦然, 互為因果. 此結論已廣為人知, 但是卻對於應用上幫助甚少. 原因在於, 過去靠單一研究某訊息傳導的方法, 並無法窺探複雜系統(complex system)排列組合交錯的驚人可能性(robustness), 也就是以管窺天, 無法究其全貌. 然而, 臨床, 應用科學實務上, 簡化是重要的科學工具, 換言之, 倘若觀察一個物體的表面, 或是和表面有關聯, 具代表性的分子, 較為容易實際. 所以, 我改弦易徹--- 是否可以藉由觀察表面即可判斷內部整體變化的狀態(state), 而不必逐一分析擊破? 因此, 我的科學邏輯策略是, 先找到組織表面某一和環境(或是細胞外間質extracellular matrix (ECM))互動密切的分子. 然後, 因為通常這類表面蛋白都具有雙向(bidirectional)溝通功能, 內到外(inside-out)或是外到內(outside-in), 因此我們就可以一方面探討其動態變化是否和 表面構造 (組織-細胞外間質介面, tissue-ECM interface)變化有關聯; 另一方面觀察/整合 此蛋白和複雜內部系統是否有動態變化的關聯. 這部分的研究成果也發表論文於J Trauma 2010. 我所找到的表面蛋白是細胞結合蛋白(cell adhesion molecules, CAMs), 其中和環境相關的是整合素(integrin). 目前我得到結論:

a. integrin和組織表面結構複雜度(surface complexities)有統計正相關!
除了上述肌肉組織已驗證之外, 我也初步延伸推廣此推論於光滑, 球狀, 良性的子宮肌瘤(uterine leiomyoma). 其整合素integrin alphav也和表面結構複雜度相關 (也就是說, 光滑的子宮肌瘤相對於表面複雜的正常組織有非常低的整合素表現), 此論文已發表於國際期刊 Gynecol Obstet Inves 2010 ;

b. 整合素本身與其下游訊息傳導分子的時間序表現也具有和上述肌肉組織一樣的同時性(coherent)與雙相性(biphasic)動態模式

 

(3) 確認整合素與表面複雜度的高度關聯之後, 我同步建立生物數學模型(Biomathematical model)來預測生物現象. 例如:

a. 預測癌症的侵入與轉移行為 (cancer invasion and metastasis), 並作in vitro細胞, in vivo老鼠實驗以及人類癌症檢體來驗證模型對於癌症的預測, 並希望未來進一步發展藉由控制組織表面的治療方法, 我稱之為global surface control. 目前的癌症藥物所採用的策略, 就是單一訊息傳導抑制藥物, 或是至多合併幾種訊息傳導抑制藥物, 但是都有其限制. 原因就是複雜系統利用單一因素控制無疑是違背邏輯的!! 我的想法是藉由控制/調控癌症表面, 不必針對單一訊息傳導分子. 換言之, 掌控了大方向, 就不必拘泥細節, 因為組織內部會自行調整其生物狀態該有的整體表現.  這就像是政府管理人民, 沒必要逐一緊迫盯人, 只要公佈政策, 或是掌握團體的關鍵人物即可. 我的模型還幫助了我本身自己癌症預防(cancer prevention)與健康保健的策略 (終於證明了研究也不是完全是理想大於實際的科學無用論喔)!!

b. 了解皮膚皺摺與整合素相關之外, 運用物理的皺摺理論來改良眼袋手術以及皮膚保養的方法.
 
首先分析肉毒桿菌素注射與切神經差別的論文:

此論文的特點是世界上首篇同時分析比較肉毒桿菌素注射(Botulinum A toxin (BoNT-A) injection)與切神經(Neurectomy)差異的論文, 也是我一系列生物數學模型論文的第1篇. 去神經化(Denervation) 是非常重要的醫學現象, 也衍生出現代廣為運用的臨床治療. 肉毒桿菌素屬於利用化學藥物暫時阻斷神經傳導物質(chemodenervation), 是可逆的變化; 相對而言, 神經受損(nerve injury)或切斷(neurectomy or transection)則是永久的神經損害, 是不可逆的. 肉毒桿菌素注射已經廣泛被許多科別用於治療, 例如疾病部分: 復健或神經內科用於upper motor neuron syndrome患者的spasticity, 也有用於美容用途, 如整形外科或皮膚科. 至於切神經或是神經斷裂, 在神經外傷損害的研究早已是熱門領域, 即便於臨床治療功能恢復上無法達到患者滿意的程度, 其仍舊是人類急欲解決的議題. 然而在整形美容方面的運用, 我已經發展蘿蔔腿選擇性神經切除術(selective neurectomy for calf reduction) 治療多年, 除了成功達到滿意的臨床效果之外, 也發表多篇論文於國際期刊上. 雖然上述兩種去神經化已大量臨床運用, 但是不代表機轉已經完全了解, 仍舊存在許多關鍵問題需要努力.
 
  譬如說, 過去我們都認為肉毒桿菌素注射只能維持不到半年, 所以許多診所怕消費者不施打, 普遍都會說多打幾次就會定型? 但是這種說法其實並沒有研究根據. 再者, 肉毒桿菌素打半年之後, 肌肉重量與功能真的會完全回來嗎?  到底多打幾次之後, 效果會不會加成 (additive effect), 加成效果大約如何? 肉毒桿菌素注射與切神經的最大效果(maximal effect) 什麼時候會發生? 肉毒桿菌素的效果已經確定是暫時的, 如果能夠延長作用該有多好?! 因此, 比較肉毒桿菌素與切神經的分子機轉差別, 是否可以給我們一點線索? 等等許多代解的問題, 文獻上卻幾乎沒有深入研究, 或是目前只有缺乏嚴謹設計分析的臨床論文. 畢竟這些問題都很重要, 必須藉由控制精準的動物或是分子生物實驗來給我們解答, 而非純粹利用人類的數據. 畢竟人類的研究問題重重, 例如: 無法把肌肉真的切下來, 一些科學檢查也不好做, 控制變項闕如等等. 況且, 本研究還有和其他文獻不同的地方就是, 此實驗的時間設計長達58週. (有做過老鼠實驗的人都知道, 非常辛苦, 不容易, 而且每個時間點老鼠都要五隻--為了這次實驗不僅橫跨一年, 老鼠也用了一百多隻). 本研究也有其他優勢, 就是祚者有人類針對蘿蔔腿的肉毒桿菌素注射與切神經的臨床經驗與數據, 可以和老鼠動物實驗放在一起分析比對.

 左圖是肉毒桿菌素注射(1.5 and 1 ng/kg body weight)與切神經 (為了和人類蘿蔔腿的手術一致, 因此老鼠實驗設計採用: 選擇性切腓腸肌神經(selective neurectomy for nerve to the gastrocnemius muscle), 換言之 就是專一切斷某肌肉的神經, 而不是切斷過去文獻常做的 控制整條腿許多肌肉群的 坐骨神經(sciatic nerve) 或是 前脛骨肌神經 (nerve to tibialis anterior muscle)), 因此, 可以真正模擬臨床selective neurectomy案例之外, 也可以避免其他肌肉干擾的誤差 (bias). 老鼠實驗的各時間點肌肉取樣時間表(每個時間點統計上有意義的老鼠數目是5隻, n=5), 可以得到不同時間點的肌肉樣本.

 

得到老鼠肌肉重量在各組實驗的數據: 切神經在前八週重量呈現迅速下降, 指數遞減(exponential decay), 到第二十六週時肌肉重量只剩原來的11.6+/- 2.1%. 至於肉毒桿菌素注射, 因為是可逆 的確可以看見上圖呈現V型反轉的曲線, 都是注射後第四週反轉(trough), 無論是第一次或是追加的第二次注射結果都是如此. 也就是注射肉毒桿菌素第四週會達到最大的萎縮效果, 然後再逐漸"恢復"?! 問題就來了, 肉毒桿菌素施打之後, 過去都認為可逆, 但是很籠統, 到底是真的會完全恢復, 還是不完全? 我做這個實驗時, 本來以為會很快恢復到原來, 結果令人驚訝, 即使一次全劑量注射追蹤長達58週, 肌肉也只能恢復到89.3+/-3.8%, 此結果和 Lee et al. 2007年的研究結果相吻合. 所以, 肉毒桿菌素其實在廠商或文獻上以為會"完全"恢復的時間, 其實會有仍舊持續不恢復效應存在. 即使若干基礎研究指出肉毒桿菌素注射後, 藉由NMJ stabilization, remodeling以及 myogenesis會"完全"恢復? 本研究結果指出, 事實上並非如此 (Rogozhin et al., 2008; Shen et al., 2006). 簡單的說, 肉毒桿菌素注射造成的肌肉萎縮, 即使長達一年後, 肌肉恢復仍舊是不完全的.

 

  如果是重複注射呢? 廠商和醫學界都跟患者說肉毒桿菌素注射半年就會恢復, 那以半年為基數, 到底肌肉重量是如何? 診所那些稀釋到誇張的注射量, 到底會產生怎麼樣的效果, 一定會效果不好嗎? 也就是劑量較低會影響嗎? 結果顯示26週(半年), 全劑量與半劑量注射分別恢復到 72.7+/-3.7% 和 83.7+/-4.5%, 同樣的老鼠半年後追加第二次注射後, 肌肉重量在離第一次注射58週後, 會恢復到58.3+/-6.1%, 以及 70.3+/-8.2%. 所以結論是: 肉毒桿菌素注射的效果和 劑量(dose)與次數(frequency)有關, 也就是會有加成作用(additive effect). 誰說研究無用, 從今天開始我們不必再心虛的跟患者說籠統的話, 或者像某些診所為了怕客人跑掉, 硬扯什麼打三次就會定型的鬼話. 進一步分析, 如果用數學外插法, 肉毒桿菌素注射打一次, 大概要兩年半才會幾乎回到原始出發點, 加上似乎每次打每半年都只能恢復到八成左右, 所以數學乘起來, 打個兩, 三次就得花上五至七年才能恢復, 所以夠划算的啦!!
老鼠實驗結果如此, 人類呢?

 

因為人類不可能在各時間點把肌肉切一些下來 (無法找到足夠統計分析數量的美容患者, 就算找到幾位, 也不可能完全配合, 如反覆於不同時間點做biopsy), 因此本研究採用一維的數據, 也就是小腿圍差距(pre- and post-treatment difference of human maximal calf circumference)來觀察. 結果: 肉毒桿菌素注射小腿圍縮小的差距幅度是第4週最大, 然後完全恢復; 神經切除則是第8週之前萎縮最快, 呈直線下降, 然後趨勢呈水平趨緩.

 

  去神經化影響肌肉萎縮的程度量化分析之後, 接下來分析功能改變呢? 老鼠腿部的肌肉功能分析(functional assessment), 乃利用walking track analysis, 此實驗乃讓老鼠在 10x60-cm 軌道上測量足跡的數據, 如
(1) distance from the heel to the third toe (i.e., the print length[PL]);
(2) distance from the first to the fifth toe (i.e., the toe spread [TS]);
(3) distance from the second to the fourth toe (i.e., the intermediary toe spread [ITS]). 然後實驗的那隻腳稱為E, 正常的稱為N, 接著套入公式計算坐骨神經功能指標Sciatic functional index (SFI). 得到數據圖如下所示:

正常的SFI數據是-8.8, 最嚴重的功能障礙為-100. 由於腿部功能都是整體肌肉群分析, 而本研究的老鼠實驗施打肉毒桿菌素或是切神經都是專一, 針對單一肌肉. 所以, 單一肌肉容易被其他肌肉功能"代償"彌補(compensation). 結果呈現: 功能立即先受到影響, 但是恢復也很快. 肉毒桿菌素注射一週到達功能缺損的高峰, 然後迅速恢復, 這結論和過去咀嚼肌咬合力道恢復的時間研究相同 (Ahn and Kim, 2007; Kim et al., 2009); 切神經則在一至四週就達到功能缺損高峰, 然後很快就恢復. 不過, 即使到第26週也不會恢復到正常, 會有殘留的功能缺損 (a residual functional deficit, SFI=-19.6 +/-2.1%). 肌肉功能缺損的程度取決於 去神經化肌肉的程度與數量 (the degree of the motor function deficit depends on the extent and number of denervated muscles)以及 代償肌肉的代償能力.

 

 綜合上述肌肉重量與功能的研究結果, 我們得知: 去神經化先影響肌肉功能, 然後再對肌肉重量產生下降萎縮的影響. 本研究由動物實驗得到的結果, 對於肉毒桿菌素施打臨床上有何意義? 由於一般所謂肌肉功能都是一組(群) 肌肉群所形成, 所以當我們想要減低某種肌肉功能時(如 針對魚尾紋, 皺眉紋, 抬頭紋等動作產生的 動態功能皺紋(dynamic wrinkles), 必須施打"一群"肌肉. 因為本實驗證實針對單一肌肉, 功能會很快完全恢復; 相反的, 如果我們想要減少肌肉質量體積時(如針對國字臉咀嚼肌肥大(masseteric muscle hypertrophy)), 則必須精準施打想要瘦, 想要萎縮的特定肌肉. 如此, 除了可以達到理想的效果, 減少副作用之外, 也可以減少肉毒桿菌素施打的成本或浪費.

 

  接著, 藉由分析存活與細胞凋亡訊息這兩條完全相反對抗的訊息傳導路徑, 來比較兩組去神經化的差異. 15年前 Tsichlis laboratory 發現了 存活(survival) 訊息傳導的主要路徑是 PI3-K/Akt (Namikawa et al., 2000; Schwaiger et al., 2000). 首先, 細胞內酶 PI3K (phosphoinositide 3-kinase 或 PtdIns-3-OH kinase) 磷酸化 細胞膜的磷酸脂 phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 成為 phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, 這個分子會產生另一種非常關鍵的serine/threonine kinase 酶 結合所需的位置, 此酶就是 Akt/protein kinase B (PKB).  (Franke et al., 1995) Akt下游直接與間接相關的訊息傳導分子有 glycogen synthase kinase 3 (GSK3),  mammalian target of rapamycin (mTOR), p70S6K, 以及 PHAS-1 (4EBP-1)等等. In vivo 藉由引入突變的Ras construct 單純活化 PI3K導致肌肉再生肥厚 (Murgia et al., 2000); 反之, 利用藥物 LY294002抑制PI3K活性, 可以抑制 IGF-1 引發的肌肉肥厚現象 (Rommel et al., 2001). 總之, 活化的Akt可以預防肌肉萎縮之外, 它的酶活性對於IGF-1 導致的肌肉肥大非常重要 (Bodine et al., 2001; Song et al., 2005).

 

  至於細胞凋亡(apoptosis)則是在不會影響週圍組織的情況下, 高度調節的細胞自毀現象, 其分成外在(extrinsic)與內在粒腺體(intrinsic)兩種大路徑 (Tang et al., 2000).  肌肉的細胞凋亡只會導致肌細胞核(myonuclei apoptosis)與其相關的肌細胞質(sarcoplasm)的凋亡, 但是卻不會導致整個肌纖維的消失. 換句話說, 去神經化導致肌細胞核凋亡只會減少多核的骨骼肌肌纖維的大小, 而不會導致肌細胞死絕. 因此, 只要有辦法消除去神經化的傷害, 肌細胞仍舊可以恢復的. 就像是氣球吹大或是變小一樣, 汽球都在, 只是體積改變. 內在粒腺體細胞凋亡路徑, 可以再細分成 硫胱氨酸蛋白酶-依賴 與 -獨立 細胞凋亡路徑 (cysteine aspartate-specific protease(caspase)-dependent and-independent apoptosis), 而走哪一條路徑, 則取決於年齡, 造成肌肉萎縮的條件, 肌肉種類 (如快, 慢肌)等等因素.

 

  caspase-dependent 路徑肇始於粒腺體內容物 cytochrome c 的釋出, 然後接著活化 initiator caspases (如 caspase-9), 最後作用於 caspase-3 引發細胞凋亡. 此條caspase-dependent 路徑產生細胞凋亡現象的同時, 當然也會有調節蛋白來控制其變化, 像是 抗細胞凋亡蛋白 (anti-apoptotic, 如 Bcl-2) 或是 原始細胞凋亡蛋白(pro-apoptotic, 如Bax). Bax 這些細胞凋亡蛋白平常儲存在細胞膜間隙的compartment中, 釋出後, 其會插入粒腺體的外層細胞膜, 產生孔洞 (mitochondrial permeability transition pores (mPTP)), 再引發更多caspase-dependent 細胞凋亡連鎖反應, 也會導致下述caspase-independent AIF (apoptosis-inducing factor)從粒腺體釋出. 文獻上, Adhihetty 等人於2007年發現去神經化會導致粒腺體內容物釋出而減少. Siu 和 Always 於2005年就發現去神經化會增加 Bax-to-Bcl-2 ratio, 也就是說細胞凋亡調節蛋白超過抗細胞凋亡調節蛋白, 當然會導致 caspase-dependent 細胞凋亡的結果. 不過, 大多數的研究都是短期(如14天), 所以當然得到的結果都是切神經導致"一大堆"細胞凋亡相關訊息傳導分子(無論是caspase-dependent 或是-independent) 增加, 無法更清晰分辨哪些是重要的關鍵.

 
  至於另一條caspase-independent 路徑則是以 細胞凋亡誘發因子 AIF 主導. 它是一種位於粒腺體膜內空間(intermembrane space), 且具NADH-oxidase活性的flavoprotein. (Ferreira et al., 2008; Vahsen et al., 2004). AIF可以跳過caspase這條路徑, 直接translocate到細胞核, 引發DNA fragmentation. 總之, 我的研究設計乃針對細胞凋亡(兩種路徑與調節蛋白), 以及 存活訊息路徑 來分析比較兩組的實際差異.

 

邏輯上, 存活(survival)與細胞凋亡(apoptosis)兩條訊息傳導路徑表現誰表現比較強, 自然哪一種反應就主導組織的結局. 我的實驗結果顯示訊息傳導分子表現驚人的同時(coherent)與雙相(biphasic)性!! 也就是組織的分子表現同時先達到高峰, 再一起下降. 這和過去一些研究, 尤其是只研究去神經化一兩週的短期研究相比, 他們大多觀察出二分法 (dichotomy) 的結論, 也就是一起增加或是一起減少, 相反的, 我的長期研究客觀呈現上述兩種趨勢合併的客觀觀察.

 

  去神經化兩組的存活訊息傳導分子蛋白表現 (PI3-K 和 p-Akt), 肉毒桿菌素注射組和切神經組分別在第4週 和 第8週達到高峰, 然後遞減至接近正常. 當然可以清楚看到, 切神經畢竟是較大的傷害, 組織代償對抗傷害的存活訊息自然會反應較高, 最高峰的表現是正常的28.6倍, 不過儘管高表現隨後下降, 其表現量仍舊維持在正常之上. 換言之, 切神經的嚴重神經傷害, 即使經過一段長時間, 肌肉纖維仍舊努力維持肌肉的存活, 所以存活訊息(p-Akt)維持一定的水平, "等待"有一天肌肉纖維能夠有機會復原, !!
 

 

 

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